当测序后生成的fastq文件比对到到基因序列后，通常会生成一个sam或者bam为扩展名的文件。由于生信分析中，大部分分析都是基于sam格式进行的分析，所以今天我就带大家深入学习一下SAM格式的文件。
认知SAM格式
什么是SAM文件？
SAM的全称是sequence alignment/map format。而BAM就是SAM的二进制文件(B源自binary)。
SAM 格式主要包括两大部分
标头注释部分（header section）
比对结果部分（alignment section）
为什么我们需要SAM格式？
SAM格式是用来来支持高通量测序数据分析：
快速查找与坐标重叠的比对。例如，选择与染色体2上的坐标323,567,334重叠的比对。
根据read的属性进行选择和过滤。例如，我们希望能够快速选择能过比对到反向链上的read。
有效地存储数据。例如，从SAM格式转化成BAM格式，单个压缩文件包含所有样本的数据，每个样本都以某种方式标记。
SAM格式的详解
标头注释部分
首先我们看一个例子：
@HD VN:1.0 SO:unsorted@SQ SN:gi|10141003|gb|AF086833.2
| LN:18959
@PG ID:bowtie2 PN:bowtie2
VN:2.2.5 CL:"bowtie2-2.2.5
/bowtie2-align-s --wrapper basic-0
-x 1976.fa -1
SRR1972739_1.fastq -2 SRR19727
39_2.fastq"
标头信息可有可无，都是以@开头，用不同的tag表示不同的信息，主要有:
@HD，说明符合标准的版本、对比序列的排列顺序（这里unsorted）
@SQ，参考序列说明 （SN:gi|10141003|gb|AF086833.2|）
@PG，使用的比对程序说明（这里是bowtie2）
LN 是参考序列的长度
比对结果部分
比对结果部分，每一行表示一个read的比对信息，包括11个必须的字段（mandatory fields）和一个可选的字段，字段之间用tag分割。必须的字段有11个，顺序固定，不可用时，根据字段定义，可以为’0‘或者’*‘，这11个字段包括：
第一列: Query Name (QNAME)
这一列代表着比对片段的（template）的编号，例如：
SRR1972739.1第二列：FLAG
这是一种常用且高效的保存多个布尔特征值的方法。
举个简单的例子: 在 SAM 格式中，当 flag 为 1，也即对应的二进制为 01 时，表示该 read 有多个测序数据 ， 一般理解为有双端测序数据 (另一条没被过滤掉)， 而 flag 为 2， 也即二进制 10 时， 表示这条 read 的多个片断都有比对结果， 通常理解为双端 reads 都比对上了， 那么就可以推断出 flag 为 3 时， 也即二进制的 11， 表示该 read 有另一端的 read 并且比对成功， 可以看到， 其实就是 01 加 10。
Flag标识对应的情况说明：
简单解析一下常见的几个标识：
要是所得出的标记不是上述列举的数字，比如83=64+16+2+1，就是这几种情况值和。这个网站可以直接通过输入你所得的标记数字，直接告诉其对应的信息：https://broadinstitute.github.io/picard/explain-flags.html
第三列： Reference Name (RNAME)
reference sequence name，实际上就是比对到参考序列上的染色体号。若是无法比对，则是*
第四列： Position (POS)
比对上的位置，注意是从1开始计数，没有比对上，此处为0；
第五列：Mapping Quality (MAPQ)
比对的质量；比对的质量分数，越高说明该read比对到参考基因组上的位置越准确
第六列：Compact Idiosyncratic Gapped Alignment Representation (CIGAR)
CIGAR 代表着简要比对信息表达式，其以参考序列为基础，使用数字加字母表示比对结果。 例如 3S6M1P1I4M
前三个碱基被剪切去除了，然后6个比对上了，然后打开了一 个缺口，有一个碱基插入，最后是4个比对上了。
具体字母意义如下：
“M”表示 match或 mismatch；“I”表示 insert
“D”表示 deletion
“N”表示 skipped（跳过这段区域）
“S”表示 soft clipping（被剪切的序列存在于序列中）
“H”表示 hard clipping（被剪切的序列不存在于序列中）
“P”表示 padding
“=”表示 match
“X”表示 mismatch（错配，位置是一一对应的）
第七列：MRNM(chr)
下一个片段比对上的参考序列的编号，没有另外的片段，这里是’*‘，同一个片段，用’=‘；
第八列：mate position
下一个片段比对上的位置，如果不可用，此处为0
第九列：ISIZE
Template的长度，mate position大于POS为正，否则为负，中间的不用定义正负，不分区段（single-segment)的比对上，或者不可用时，此处为0；Inferred fragment size.详见Illumina中paired end sequencing 和 mate pair sequencing，是负数，推测应该是两条read之间的间隔(待查证)，若无mate则为0；
ISIZE为正，说明amplicon的start 为POS,amplicon 的end为 pos + isize-1
ISIZE为负，说明amplicon的start为mate position，amplicon的end为mate position -isize-1
ISIZE为0，说明无法计算出amlicon的大小
第十列：Sequence
序列片段的序列信息，如果不存储此类信息，此处为’*‘，注意CIGAR中M/I/S/=/X对应数字的和要等于序列长度；就是read的碱基序列，如果是比对到互补链上则是reverse completed
第十一列：ASCII
read质量的ASCII编码。
第十二列：Optional fields
可选的区域格式如：TAG:TYPE:VALUE，其中TAG有两个大写字母组成，每个TAG代表一类信息，每一行一个TAG只能出现一次，TYPE表示TAG对应值的类型，可以是字符串、整数、字节、数组等。
Reference
SAM 格式最权威的解析于介绍：SAM-FORMAT
http://qinqianshan.com/sam-format/
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